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Technical article上样后样品浮出点样孔、电泳跑完条带弥散不清、明明有扩增却什么都看不见……这些在核酸电泳中最常见的“疑难杂症”，很多时候并非DNA或RNA本身出了问题，症结往往出在上样缓冲液（Loading Buffer） 的选择与使用上。
作为核酸电泳中不可或缺的核心试剂，6× DNA Loading Buffer究竟是什么、如何配制、不同配方之间该如何选择？这篇文章帮您系统梳理。
6× DNA Loading Buffer（6倍浓缩上样缓冲液）在样品上样前必须加入，它承担四项基本职能：
增加样品密度——通过甘油、蔗糖或Ficoll等增稠剂，使样品沉入点样孔底部，避免上样时飘出孔外。
提供电泳指示——溴酚蓝、二甲苯青FF等示踪染料在电场中随核酸一同向前迁移，实时反映电泳进度。
保护核酸完整性——EDTA螯合体系中的金属离子，有效抑制核酸酶对DNA/RNA的降解。
改善样品沉降——增稠剂还能减少样品在点样孔中的扩散，使条带更加集中。
之所以设计为6倍浓缩（6×） ，是为了使用时按 1份缓冲液 + 5份样品 的比例混合，稀释至1×工作浓度后上样。
市面上常见的6× Loading Buffer主要有三大类型，区别集中于增稠剂种类、染料组合以及是否含SDS。以下数据经多来源交叉验证：[1][2][3]
| 核心组分 | 经典甘油型 | Ficoll型 | SDS型（如Sigma G2526） |
|---|---|---|---|
| 增稠剂 | 30–40% 甘油 | 12–15% Ficoll 400 | 40% 蔗糖 |
| 金属螯合剂 | 30–50 mM EDTA | 30 mM EDTA | 0.1 M EDTA（pH 8.0） |
| 示踪染料1 | 0.05–0.25% 溴酚蓝 | 0.06% 溴酚蓝 | 0.05% 溴酚蓝 |
| 示踪染料2 | 0.05–0.25% 二甲苯青FF | 0.06% 二甲苯青FF | — |
| 蛋白变性剂 | — | — | 0.50% SDS |
| 缓冲体系 | 可选Tris-HCl（pH 7.6） | — | — |
染料迁移参考值（1%琼脂糖凝胶，仅供参考，实际受凝胶浓度、缓冲液类型影响）：
二甲苯青FF：TAE中约相当于4,000 bp；TBE中约4,000–5,000 bp。
溴酚蓝：TAE中约300–500 bp；TBE中约300 bp。
重要提示：含SDS的Loading Buffer具有蛋白变性能力，适用于蛋白含量较高的粗提样品。若后续涉及切胶回收或限制性酶切实验，请选择不含SDS的版本，以免SDS干扰下游酶学反应。
本方案采用0.25%染料浓度，适配常规琼脂糖凝胶电泳。若偏好更浅的背景色，可酌情减半至0.1–0.125%。
| 组分 | 用量 | 备注 |
|---|---|---|
| 去离子水 | ~5 mL（初溶）+ 补足至10 mL | 溶解染料用 |
| 溴酚蓝 | 0.025 g | 终浓度0.25% |
| 二甲苯青FF | 0.025 g | 终浓度0.25% |
| 0.5 M EDTA（pH 8.0） | 0.6 mL | 终浓度~30 mM |
| 甘油 | 3 mL | 终浓度30% |
染料预溶解：取一支15 mL离心管，加入约5 mL去离子水。先后加入0.025 g溴酚蓝和0.025 g二甲苯青FF，建议先加少量水将染料调成糊状，再逐步稀释，涡旋振荡至完全溶解，此时溶液应呈深蓝紫色、无肉眼可见颗粒。
添加EDTA：加入0.6 mL 0.5 M EDTA母液（pH 8.0），充分混匀。
加入甘油：加入3 mL甘油，剧烈涡旋振荡30秒至体系完全均一。
定容：补加去离子水至10 mL，盖紧管盖，上下颠倒混匀10–15次，再次短暂涡旋。
分装保存：按单次使用量分装（建议500 μL/管），室温避光保存（锡纸包裹或置于不透明管盒中）。如需保存超过6个月，可转移至-20°C冻存，尽量避免反复冻融。
沉淀处理：若长期存放后出现沉淀，65°C加热10分钟，涡旋复溶后即可正常使用。
操作备忘：
染料完全溶解是关键步骤，请确保无颗粒残留。
本配方无需调节pH。
使用比例：每5 μL核酸样品 + 1 μL 6× Loading Buffer，混匀瞬时离心后上样。
| 应用场景 | 推荐类型 | 判断依据 |
|---|---|---|
| PCR产物、纯化后DNA/RNA | 无SDS型（甘油型或Ficoll型） | 避免SDS抑制后续酶切、连接或回收 |
| 粗提核酸（含蛋白杂质较多） | SDS型 | SDS可解离DNA-蛋白复合物，改善条带形态 |
| 切胶回收目的片段 | 无SDS型 | 保证回收效率和下游实验成功率 |
| SDS-PAGE蛋白电泳 | SDS型（含DTT/β-ME的蛋白专用型） | 本品不适用，需选用蛋白电泳专用上样缓冲液 |
| 现象 | 根源分析 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 样品上样后飘出孔外 | 增稠剂比例不足或混合不匀 | 确保缓冲液与样品充分混匀，检查甘油浓度 |
| 条带模糊、拖尾严重 | DNA降解或上样量过大 | 确认EDTA有效；适当减少上样量 |
| 染料前缘扭曲或呈现笑脸 | 电泳电压过高或凝胶不均 | 降低电压，重新制胶 |
| 储存后出现肉眼可见沉淀 | 低温析出或蒸发浓缩 | 65°C加热复溶后涡旋混匀即可 |
| 切胶回收后下游实验失败 | 误用了含SDS的Loading Buffer | 切换为无SDS版本再试 |
自行配制Loading Buffer虽然可行，但称量微小剂量染料、等待完全溶解、担忧沉淀析出——这些琐事消耗的不仅是时间，更是实验的稳定性。
杭州富沃克生物科技有限公司 推出即用型6× DNA Loading Buffer，严格参照标准配方质控生产，溶液均一、无沉淀，开瓶即用。助您跳过配制环节的不确定性，让每一次上样都稳定可靠。
产品信息：
| 产品名称 | 规格 | 产品货号 |
|---|---|---|
| 6X Loading Buffer | 1 mL / 10 mL | FLB606-01 |
了解更多详情，欢迎咨询杭州富沃克生物科技有限公司。
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厂家联系微信号：19850855600
参考文献
[1] Sigma-Aldrich. Gel Loading Buffer 6X Tracking Dye. Product G2526
[2] b.j.vanbergenhenegouwen. Request for a 6x gel loading buffer receipt. bionet.molbio.methds-reagnts, 1999. IUBio Archive.
[3] Yeasen Biotechnology. 6× DNA Loading Buffer. Product 10213ES
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