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Technical article做蛋白实验的同学一定有过这种经历：Western Blot条带歪歪扭扭、IP做不出来、磷酸化蛋白信号弱得可怜……问题往往出在第一步——蛋白提取没做好。选错裂解液，后面全是白忙活。
RIPA裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay Lysis Buffer，放射免疫沉淀法裂解缓冲液）是实验室里最经典的细胞组织快速裂解液，堪称蛋白提取界的“万能钥匙”[1][3]。今天一篇讲清楚它到底是什么、怎么选、怎么用。
RIPA裂解液是一种利用表面活性剂（去垢剂）裂解细胞膜（包括核膜），从组织或细胞中抽取可溶性蛋白的缓冲液[1][3]。
它的核心优势：裂解能力强，能同时提取胞浆蛋白、膜蛋白和核蛋白，裂解后得到的蛋白样品可以直接用于Western Blot、免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）、ELISA等下游实验[4][6]。
简单说：选对RIPA，蛋白提取就成功了一半。
RIPA裂解液主要由三部分组成：裂解成分 + 蛋白酶抑制剂 + 磷酸酶抑制剂[1][5]。
成分 | 类型 | 核心作用 |
Tris-HCl（pH 7.4） | 缓冲剂 | 维持稳定的pH环境，保证蛋白活性[1] |
NaCl（150 mM） | 盐离子 | 调节离子强度，帮助蛋白溶解 |
NP-40或Triton X-100（1%） | 非离子型去垢剂 | 温和破坏细胞膜，释放胞浆蛋白[5] |
脱氧胆酸钠（0.5%） | 离子型去垢剂 | 强力破坏蛋白间相互作用，裂解核膜[3] |
SDS（0.1%） | 离子型去垢剂 | 强效增溶，帮助提取核蛋白和膜蛋白[2] |
配方说明：不同品牌的强RIPA配方在脱氧胆酸钠浓度上有差异，通常为0.5%~1%，具体以产品说明书为准[2][3]。本文所列配方以碧云天（Beyotime）强RIPA为参照[2]。
NP-40 vs Triton X-100：两者都是非离子型去垢剂，功能相似[5]。部分配方用NP-40，部分用Triton X-100。市面上强RIPA常用Triton X-100，中/弱RIPA常用NP-40[4][5]。
⚠️ Triton X-100法规提醒：Triton X-100（CAS:9002-93-1）已被列入欧盟Reach法规高关注物质候选清单，自2021年起在欧洲已限制使用（需申请许可）。国内实验室暂未受限，但建议关注其替代品（如Triton X-100的烷基糖苷类替代物或NP-40替代方案），以避免国际期刊投稿时的审稿障碍。
抑制剂 | 抑制对象 | 关键说明 |
PMSF | 丝氨酸蛋白酶 | 水溶液中半衰期约30-60分钟（4℃时约35分钟，室温下更短）[6]，必须现配现用，需在使用前数分钟内加入 |
Leupeptin | 丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶 | — |
Aprotinin | 丝氨酸蛋白酶 | — |
EDTA | 金属蛋白酶 | — |
NaF / Na₃VO₄ | 磷酸酶 | 保护磷酸化蛋白不被去磷酸化[1] |
RIPA裂解液根据裂解强度分为强、中、弱三类[2][4]。以下是核心区别：
对比项 | RIPA（强） | RIPA（中） | RIPA（弱） |
去垢剂组合 | 1% Triton X-100 + 0.5%脱氧胆酸钠 + 0.1% SDS[2] | 1% NP-40 + 0.5%脱氧胆酸钠 + 0.1% SDS[4] | 1% NP-40 + 0.25%脱氧胆酸钠[4] |
膜蛋白提取 | ⭐⭐⭐ 很好 | ⭐⭐ 较好 | ⭐ 一般 |
胞浆蛋白提取 | ⭐⭐⭐ 很好 | ⭐⭐⭐ 很好 | ⭐⭐⭐ 很好 |
核蛋白提取 | ⭐⭐⭐ 很好 | ⭐⭐ 较好 | ⭐⭐ 较好 |
适用场景 | 核蛋白、膜蛋白、难溶蛋白总蛋白提取 | 常规WB、IP | 温和裂解、Co-IP[4] |
选择建议[4][5]：
实验需求 | 推荐选择 | 关键考量 |
核蛋白、膜蛋白、难溶性蛋白（总蛋白WB） | 强RIPA | 充分提取，适合检测蛋白表达量变化[2] |
ChIP实验（研究蛋白-DNA相互作用） | 专用ChIP裂解液 | 强RIPA会破坏核小体结构，不适合此类实验 |
常规WB、IP | 中RIPA | 平衡裂解强度和蛋白完整性[4] |
Co-IP、需要保持蛋白天然构象 | 弱RIPA或专用Co-IP裂解液 | 温和裂解，保护蛋白相互作用[4] |
磷酸化蛋白检测 | 含磷酸酶抑制剂的RIPA | 防止去磷酸化，确保信号真实[1] |
使用前数分钟内，向RIPA裂解液中加入PMSF至终浓度1 mM（或其他蛋白酶抑制剂混合物）[6]。PMSF在水溶液中半衰期极短（约30-60分钟），必须在使用前数分钟内现配现用[6]。
如果购买的RIPA已预混抑制剂，可直接使用。
① 去除培养液，用预冷PBS洗一遍
② 按6孔板每孔150-250 μL的比例加入预冷裂解液[4]
③ 用200 μL或1000 μL移液器枪头反复吹打细胞表面5-8次（沿孔壁方向），确保裂解液覆盖整个孔底
④ 冰上放置5-10分钟[4]
⑤ 4℃、12000g离心10分钟，取上清即为总蛋白[4]
⑥ 蛋白浓度定量：取少量上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度[6]，调整各样品浓度至一致（通常为1-5 mg/mL），再进行后续实验
裂解效果检验：可用显微镜观察裂解后细胞碎片情况[1]，或比较不同裂解方法所得蛋白产量（BCA定量结果），作为裂解效果的交叉验证[6]。
① 离心收集细胞，去除培养基
② 用手指轻弹管底将细胞分散
③ 按6孔板每孔150-250 μL加入裂解液[4]
④ 冰上放置5-10分钟，期间可轻弹混匀
⑤ 4℃、12000g离心10分钟，取上清[4]
⑥ 同上进行蛋白浓度定量
① 取50-100 mg组织，冰上剪成碎片
② 用预冷PBS洗涤2次
③ 加入按1:10（w/v）比例计算的预冷RIPA裂解液（如100 mg组织加入1 mL裂解液）
④ 用玻璃匀浆器冰上匀浆20-40次[4]
⑤ 冰浴放置10分钟，每隔5分钟涡旋振荡30秒
⑥ 4℃、12000g离心10分钟，取上清[4]
⑦ 同上进行蛋白浓度定量
问题 | 原因 | 解决方案 |
裂解后出现透明胶状物 | 含有基因组DNA的复合物[4] | 不检测DNA结合蛋白时直接离心取上清；检测转录因子（如NF-κB、p53）时用超声处理打散胶状物后再离心[4] |
RIPA裂解液里有沉淀 | SDS在低温下析出[2] | 恢复室温后上下颠倒混匀或涡旋振荡数秒，待沉淀完全溶解后再使用 |
蛋白样品太粘稠 | 核酸释放过多[4] | 适当减少裂解液用量或增加离心时间；或将样品95℃加热5分钟，迅速冰浴5分钟后再离心[4] |
磷酸化蛋白信号弱 | RIPA不含磷酸酶抑制剂[1] | 检查配方；必须自行添加NaF、Na₃VO₄等磷酸酶抑制剂[1] |
裂解效率评估 | 无法判断裂解是否充分 | 用显微镜观察细胞碎片[1]，或用BCA法比较不同裂解方法的蛋白产量[6] |
自己配RIPA裂解液虽然可行，但涉及多种去垢剂、缓冲液、抑制剂的精确配比，而且PMSF半衰期极短必须现配现用——步骤繁琐，稍有疏忽就会影响蛋白提取质量[6]。
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参考文献
[1] RIPA裂解液-常用生化试剂[EB/OL]. 生物在线.
[2] Beyotime RIPA裂解液(强)产品说明书[EB/OL]. 生物谷（BioMart）.
[3] RIPA裂解液[EB/OL]. 生物谷（BioMart）, 2025.
[4] 蛋白提取系列专题——多方位获取您所需要的样本蛋白[EB/OL]. 翊圣（Yeasen）.
[5] 关于常见细胞裂解液及其组分介绍[EB/OL]. 生物谷（BioMart）, 2023.
[6] RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液[EB/OL]. 翊圣（Yeasen）, 2018.
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